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 Betreff des Beitrags: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Donnerstag, 19. Dezember 2013 13:49 
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Neuling

Registriert: Dienstag, 25. September 2012 17:46
Beiträge: 32
Hi,

wie manche vielleicht schon im Forum gelesen haben, arbeite ich zur Zeit mit Mykorrhiza Pilzen im Rahmen meiner Bachelor Arbeit. Vorweg: Das Ziel ist alles in Gewebekultur zu machen, also steril und in vitro. Da stellen sich mir noch ein paar Probleme in den Weg, wo ich etwas Hilfe benötigen könnte. Verzeiht mir bitte auch, wenn ich diese Frage eventuell in mehreren Foren stelle, jedoch muss ich nach den Weihnachtsfeiertagen unbedingt weiterkommen mit meinen Versuchen.

1. Aussieben der Sporen
Ich habe von einer Bezugsquelle mehrere Glomus Arten erhalten, welche jeweils in Sand als Substrat geliefert wurden. Ich muss die Sporen also aus dem Sand raussieben um damit steril weiterarbeiten zu können. Ich gebe also ca. 20g Substrat auf ein Sieb mit einer Maschenweite von 250µm, und halte darunter ein Sieb mit 50µm Maschenbreite. Anschließend Wasche ich für 2-3 Minuten unter Leitungswasser das Substrat durch beide Siebe. Den Inhalt des unteren Siebs wasche ich in ein Reagenzglas, und zentrifugier dieses zweimal. Das erste mal gieße ich den Überstand weg, beim zweiten mal gebe ich 50% Zuckerlösung dazu, und schütte den Überstand dann wieder auf mein 50µm Sieb. Dann wasche ich erstmal den Zucker durch, und wasche dann den Inhalt in das nächste Reagenzglas. Wenn ich nun ein paar Tropfen unter dem Mikroskop anschaue sehe ich fast keine Sporen. Nur ganz selten und eher zufällig finde ich mal eine Spore, obwohl der Verkäufer angibt, mindestens 1000 Sporen pro Gramm im Substrat zu haben.
Wo liegt also der Fehler?


2. Sterilisieren der Sporen
Ich wasche die Sporen von meinem 50µm Sieb direkt in ein Reagenzglas mit 3% NaClO Lösung + Tween 20 und mische das für ca. 10 Minuten durch. Danach sterilisier ich mein Sieb in 70% Ethanol, wasche es mit autoklaviertem Wasser, und wasche die Sporen darauf. Anschließend wasche ich die Sporen kräftig mit autoklaviertem Wasser, und wasche sie anschließend in eine Petrischale. Ist das ausreichend um die Sporen anschließend in Vitro in Kontakt mit Pflanzen zu bringen? Diesen Schritt hab ich in der Praxis noch gar nicht unternommen, da ich schon beim aussieben der Sporen scheitere.

Ich bin für jede Hilfe und für jede Idee dankbar.

Mit freundlichen Grüßen
Giftpilz

P.S.
Mein Betreuer hat zwar schonmal mit Mykorrhiza Sporen gearbeitet, aber hat selber noch keine Erfahrung mit Nasssieben gemacht und kann mir deswegen auch nicht weiterhelfen.


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 Betreff des Beitrags: Re: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Donnerstag, 19. Dezember 2013 19:06 
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Ehren - Member

Registriert: Montag, 23. August 2010 17:52
Beiträge: 246
Wohnort: tiefster Ruhrpott
Hallo Giftpilz,

darf man fragen was und wo du studierst?

Zu deinem Problem stellen sich mir einige Fragen:

1.) Weißt du wie groß die Sporen deiner Glomus Arten sind/sein sollten?

2.) Du scheinst dich nach einem bestimmten Protokoll zu richten.
Woher hast du dieses Protokoll und was wurde ursprünglich mit diesem Protokoll isoliert?

Aussieben der Sporen:

1.) Sind die Angaben der Sporenmenge des Anbieters verlässlich/glaubwürdig?
bzw. woher hast du die Sporen?

2.) Du benutzt ein Sieb von 50 mikrometern Maschenweite.
Sind deine Sporen kleiner oder größer als die Maschenweite?
Sammelst du die gesamte Flüssigkeit mit der du wäschst?
Oder fängst du nur das auf was in den 50 mikrometern hängen bleibt?

3.) Was für eine Funktion hat der Zucker?

4.) Angenommen du hast bis hierhin alles gut gemacht und alle Sporen aus deinem Sand herausgewaschen.
Deine Ausgangsmenge waren 20g also ca 20 000 Sporen.
Dein Reagenzglas hat ca 10 bis 20 ml,
also ca 1000 bis 2000 Sporen pro ml (Im Idealfall).
Wenn du nun eine Lösung der Sporen auf einen Objektträger tropfst,
und mit einem normalen Deckgläschen abdeckst, dann hast du ca 5 mikroliter Flüssigkeit
auf dem Objektträger.
Das sollten dann so ca 5-10 Sporen pro Objektträger sein (maximal).
Wenn man diese unter dem Mikroskop sucht, dann sieht das nicht nach sehr vielen
Sporen aus.

Ich hoffe dich richtig verstanden zu haben und hier keine groben Rechenfehler gemacht zu haben.
Alles weitere sollte man danach klären.

schöne Grüße
Fabian


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 Betreff des Beitrags: Re: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Donnerstag, 19. Dezember 2013 22:42 
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Pilzfreund

Registriert: Montag, 13. Dezember 2010 21:03
Beiträge: 81
Die Sporen solltest du direkt ohne Vorbehandlung auf antibiotischem Nährmedium aussäen und anschließend selektieren (um ggf. andere Schimmel und Hefen zu entfernen). Mit NaOCl killst du die Sporen.


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 Betreff des Beitrags: Re: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Freitag, 20. Dezember 2013 22:57 
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Neuling

Registriert: Dienstag, 25. September 2012 17:46
Beiträge: 32
Vorweg schonmal vielen Dank für die Antworten.

Zitat:

1.) Weißt du wie groß die Sporen deiner Glomus Arten sind/sein sollten?

Laut Literatur schwankt die Größe zwischen 40 und 200µm. Abhängig vom Zustand des Pilzes und den Bodengegebenheiten (Stichwort: Bodenverdichtung).

Zitat:

2.) Du scheinst dich nach einem bestimmten Protokoll zu richten.
Woher hast du dieses Protokoll und was wurde ursprünglich mit diesem Protokoll isoliert?

Es sind in der Regel Protokolle zum aussieben von Pilzsporen aus Bodenproben. Sollte also passend sein für meinen Fall.


Zitat:

1.) Sind die Angaben der Sporenmenge des Anbieters verlässlich/glaubwürdig?
bzw. woher hast du die Sporen?

Ein Anbieter hat sich auf Mykorrhiza spezialisiert und sollte daher schon glaubwürdig sein. Über den anderen Anbieter kann ich nichts sagen. Ich probiere standardmäßig immer die Bodenproben von beiden Herstellern auszusieben.


Zitat:

2.) Du benutzt ein Sieb von 50 mikrometern Maschenweite.
Sind deine Sporen kleiner oder größer als die Maschenweite?
Sammelst du die gesamte Flüssigkeit mit der du wäschst?
Oder fängst du nur das auf was in den 50 mikrometern hängen bleibt?

Die allermeisten Sporen sind größer als 50µm. Ich fange nur auf was in den 50µm Sieb hängen bleibt. Dazu gehören viele kleine Bodenpartikel/"Schmutz" und eben auch die Sporen.


Zitat:

3.) Was für eine Funktion hat der Zucker?

Der Zucker bildet einen Konzentrationsgradienten und dient zum trennen der Sporen von den Bodenpartikeln, welche unerwünscht sind. Die Sporen bleiben im Überstand, welchen ich nur noch umschütten muss, die Bodenpartikel bleiben als Bodensatz im Gläschen kleben.


Zitat:

Das sollten dann so ca 5-10 Sporen pro Objektträger sein (maximal).


Auch auf die Gefahr hin, dass ich mich als unwissenschaftlicher Laie oute, aber weils komfortabler ist, hab ich quasi keine Objektträger verwendet, sondern saubere Deckel von Petrischalen. Darauf hab ich dann ein paar Tropfen der Sporenlösung gegeben, bis der Deckel vollständig benetzt ist. Hab ich mir damit die Chance verbaut die Sporen vernünftig betrachten zu können?! Dass die Sporendichte stark abnimmt stimmt natürlich trotzdem.

Zitat:
Die Sporen solltest du direkt ohne Vorbehandlung auf antibiotischem Nährmedium aussäen und anschließend selektieren (um ggf. andere Schimmel und Hefen zu entfernen). Mit NaOCl killst du die Sporen.


Ich hab in zwei Veröffentlichungen gelesen, dass die Sporen mit 2% NaClO (bzw. Chloramin-T) für zwei Minuten oberflächensterilisiert wurden. Scheinbar beeinflusst dies die Keimrate nicht all zu stark.
Dennoch würde mich das System mit dem antibiotischem Nährmedium interessieren. Ich habe also mein Nährmedium, gebe darauf die Sporen, und warte bis die Sporen keimen. Ich beobachte durchs Mikroskop, ob ich Mycelstücke sehe, welche keine weitere Kontamination aufweisen, und gebe danach diese Sporen bzw. Mycelreste auf meine Wirtspflanze? Ist das so korrekt?


P.S.
Ich studiere Gartenbauwissenschaften und mache mein Arbeit im Lehrstuhl für Obstbau. Dort wurde zwar schon mit Mykorrhizen gearbeitet, aber bisher noch nicht unter sterilen Bedingungen, weswegen mir kein Mitarbeiter behilflich sein kann. Und ja, ich hab mir das Thema selber ausgesucht :-)


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 Betreff des Beitrags: Re: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Montag, 06. Januar 2014 08:07 
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Hallo Giftpilz,

Hast du schon eine Antwort über Dein "Antibiotisches Nährmedium" gefunden?
Ansonsten hätte ich da noch eine Idee...


Liebe Grüße,

Geri

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 Betreff des Beitrags: Re: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Dienstag, 07. Januar 2014 23:57 
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Neuling

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Ich konnte über die Weihnachtsfeiertage leider nicht ins Labor, von daher, leider nein.

Morgen werd ich mein Glück probieren und viele verschiedene Varianten testen, darunter auch ein Antibiotisches Nährmedium. Das Ergebniss zeigt sich dann wohl erst in ein paar Tagen.


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 Betreff des Beitrags: Re: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Mittwoch, 08. Januar 2014 07:59 
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Hallo,
Mich als Chemiker interessiert natürlich, was du hier eingesetzt hast!
Willst es uns erzählen oder ists geheim (wegen Patent, Publikation usw. oder so?)

Danke!
Liebe Grüße!
Geri

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 Betreff des Beitrags: Re: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Dienstag, 18. März 2014 15:34 
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Neuling

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Hallo.

Tut mir Leid für die späte Antwort, ich war wohl zu beschäftigt :roll:

Also im Grunde lag es nur daran, dass ich die Erde mit den Sporen vorher 30 Minuten mit Wasser rühren muss, damit sich die Sporen lösen. Das danach erfolgte Nasssieben brachte tausende von Sporen zum Vorschein.

Zum sterilisieren: Ich hab es letzlich auch ohne antibiotisches Nährmedium geschafft. Der Trick ist wohl einfach 96% Alkohol. In einer Veröffentlichung hab ich gelesen, dass mehrminütiges Behandeln der Sporen mit Alkohol zu keiner signifikant schlechteren Keimrate führt. Also hab ich die Sporen nun 1min in 96% Alkohol gegeben, und danach für 15min in 2% NaClO mit Tween 20. Versuche auf MM Medium zeigten keine Kontamination.

Im Anhang hab ich noch ein Bild wo ich wiedermal eure Hilfe benötige. Es zeigt Tomatenwurzeln in einer dual-axenischen Kultur mit Glomus mosseae. Ich hoffe, man sieht hier sich bildende Mykorrhiza Sporen.
Handelt es sich dabei wirklich um Mykorrhiza Sporen, oder doch eher um einen anderen Pilz? Oder Sind das einfach nur Wassertropfen an den Haarwurzeln?

Edit: Es handelt sich bei der Veröffentlichung um:
Sri Wilarso Budi, Bachar Blal, Silvio Gianinazzi: Surface-sterilization of Glomus mosseae sporocarps for studying endomycorrhization in vitro


Dateianhänge:
P1210708.JPG
P1210708.JPG [ 484.08 KiB | 5173-mal betrachtet ]
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 Betreff des Beitrags: Re: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Dienstag, 18. März 2014 22:53 
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Hallo!
Danke für die Info bezüglich der Alkoholtoleranz von Sporen!

Was dein Bild angeht,... Ich denke das sind Wassertröpfchen. Vergleiche die Form mit der “Sollform” deiner Sporen die du erwartest.

Liebe Grüße...

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 Betreff des Beitrags: Re: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Mittwoch, 19. März 2014 13:10 
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Neuling

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Naja, die Form würde schon mehr oder weniger passen, auch, dass sich eine Seite der Tropfen bereits dunkler färbt. Deswegen bin ich mir eben nicht so ganz sicher.
Wenn ich Sporen aus der Erde auswasche, dann finde ich ganz viele, die diese typische rote Färbung haben, und auch ein paar, die farblos erscheinen, siehe hier:

http://commons.wikimedia.org/wiki/File: ... d_soil.JPG
Bei diesem Bild sehe ich so ein Teil in der zweiten Maschenreihe von links, mittig im Bild.
(Die Bilder von samson90 stammen übrigens von mir).


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 Betreff des Beitrags: Re: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Sonntag, 23. März 2014 21:42 
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... huch,... echt speziell, Deine Sache hier.
Schätze, da bist Du der Profi,
:shock: nachdem die Sporen eine sehr runde Form haben und glatt sind fällt die Unterscheidung vom Wassertröpfchen natürlich sehr schwer.
Wie sieht es aus mit dem Versuch die über einen Polarisationsfilter zu betrachten, kriegt man hier den Unterschied zum Wassertröpfchen besser heraus?

Liebe Grüße,
Geri

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 Betreff des Beitrags: Re: Arbeiten mit Mykorrhiza Sporen
BeitragVerfasst: Sonntag, 23. März 2014 23:33 
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Neuling

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Beiträge: 32
Daran hab ich noch gar nicht gedacht. Mir fehlt eben doch die nötige Laborerfahrung, für diese Feinheiten.
Problem ist nun, solche "Wassertropfen" nochmal zu finden. Ich kann das Bild aber auch mal meinem Professor zeigen, vielleicht weiß dieser mehr.

Außerdem werd ich bald Apfelbäumchen-Wurzeln betrachten/einfärben. Zumindest hoffe ich dann, eine funktionierende Mykorrhizierung zu entdecken.


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