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 Betreff des Beitrags: Osmolarität von Pilzmedien
BeitragVerfasst: Samstag, 13. September 2014 19:16 
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Registriert: Sonntag, 29. September 2013 18:19
Beiträge: 52
Hallo zusammen,
in der Zellkultur oder der Mikrobiologie wirft man die Zellen ja nicht einfach in destilliertes Wasser, sonder benutzt spezielle Pufferlösungen, die zum Einen zur Stabilisierung des pH-Werts als auch zur Einstellung der Osmolarität eingesetzt werden.
Nun sind Pilze scheinbar nicht ganz so wählerisch wie beispielswesie tierische Zellen, die einem schon relativ geringe Schwankungen in pH und Osmolarität übel nehmen. Allerdings bin ich momentan dabei etwas mit Flüssigmedien und Agarrezepturen rumzuspielen und beispielsweise den pH wie beim Sabouraud-Agar mittels Natriumdihydrogenphosphat leicht ins saure zu Verschieben und somit gleichzeitig zu puffern. Den selben Effekt hat ja die Gipszugabe zum Substrat (ist nur weniger definiert).

Dummerweise habe ich momentan keine Ahnung bei welcher Osmolarität sich Pilze am wohlsten fühlen, also wie hoch ich das Natriumdihydrogenphosphat konzentrieren soll, dass es zum Einen eine gute Pufferwirkung hat, aber zum anderen auch im physiologischen Bereich liegt.

Eine andere Anwendung ist die Kultur von Flüssigmycel. Dazu habe ich Zellkulturflaschen mit 50ml Gesamtvolumen mit 10ml MEA-Medium gefüllt und bewachsen lassen. Innerhalb weniger Tage war aus den wenigen, kleinen, gut verteilten Mycelstückchen eine massive galertartige Masse gewachsen, die auf der Oberseite die typische flauschige Morphologie von Mycel auf Agarplatten auswies. Zur Weiterverwendung in Mycelspritzen wollte ich die Flaschen nun mit einem nährstoffreien bzw. nährstoffarmen Medium (sie haben ja noch genug vom MEA) auf 50ml auffüllen, das Ganze mittels Vortex homogenisieren und in Spritzen abfüllen.
Nun ist die Frage, womit soll ich das Ganze auffüllen? Destilliertes Wasser dürfte die guten in ziemlichen osmotischen Stress versetzen. Meine Überlegungen gingen ein wenig in Richtung PBS-Puffer. Eventuell etwas angesäuert (pH~6) und mit Zugabe von ein wenig Glucose (für die lange Zeit im Kühlschrank :P ).
Habt ihr eine Idee dazu?

Viele Grüße
Christoph


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 Betreff des Beitrags: Re: Osmolarität von Pilzmedien
BeitragVerfasst: Samstag, 13. September 2014 21:45 
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Registriert: Mittwoch, 25. November 2009 22:02
Beiträge: 408
Wohnort: Wentorf bei Hamburg
Hi Christoph,

ich verstehe die Frage nicht. Dein Mycel hat sich doch scheinbar gut vermehrt. Warum willst du da weitere Zwischenschritte einbauen. Das erhöht doch nur das Konti-Risiko.

Wenn du PBS zur Verfügung hast, ist das schon mehr als genug. Da brauchst du dir um Osmolarität keine Gedanken mehr machen. PBS wird unter anderem für Zellkulturarbeiten verwenden, bei denen mit viel empfindlicherem Zellmaterial gearbeitet wird, z.B. PBMCs oder Krebszelllinien …. .
PBS ist tendenziell mit Kanonen auf Spatzen schießen, siehe Forum Honig, isotonische Kochsalzlösung …. , das klappt auch prima. Oder siehe das „einfache Rezepte“ von Stamets (1 Liter Wasser, 40 g Malzextrakt, 3-5 g Sägemehl, 2 g Trockenhefe, 1 g Gips).

Wenn du trotzdem in die Tiefe gehen willst, würde ich dir eine Recherche bei PubMed empfehlen und ein paar Papers durchschauen z.B.: http://www.e-jmii.com/article/S1684-1182(14)00077-2/fulltext#sec2. Im Material Methodenteil findest du antworten.

Zur Konservierung ist das ganz interssant: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3209878/. Agarstück in 10 %iger Glyerinlösung, soll vital bleiben zumindest bei Pleurotus. Kannst du auch vortexen und dann ab in den Freezer.

VG


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 Betreff des Beitrags: Re: Osmolarität von Pilzmedien
BeitragVerfasst: Sonntag, 14. September 2014 13:18 
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Foren - Mitglied

Registriert: Sonntag, 29. September 2013 18:19
Beiträge: 52
Hi reblaus,
Danke für deine schnelle Antwort (sowas kenne ich ja garnicht aus diesem Forum :P ).
Zu deinen Fragen: ich arbeite in einem mikrobiologischen Labor und darf gnädigerweise die Geräte und Materiealien nach Feierabend für private Zwecke (Pilzzucht) nutzen. Aus diesem Grund möchte ich gleich definierte Medien und keine Haushaltszutaten (Sägemehl, Trockenhefe) mit schwankenden Zusammensetzungen einsetzen. Bei der Gelegenheit wollte ich meine Medien dann auch entsprechend puffern (muss nur zusätzlich etwas NaH2PO4 abwiegen). Auch die Konterminationswarscheinlichkeit ist ist durch den Einsatz einer Cleanbench nahezu Null.

Die Idee mit der Verdünnung kam daher, dass ich momentan schon fast zuviel Mycel im Flüssigmedium habe, was in Spritzen dann gerne mal die Kanülen verstopft. Daher möchte ich das Ganze mit Minimalmedium verdünnen (Vgl. Mediumwechsel in der Zellkultur), darin homogenisieren und dann in Spritzen einlagern.
Für die Langzeitkonservierung probiere ich momentan gerade die Methode des Einkieselns aus ( viewtopic.php?f=59&t=3675 ). Das hat in meinen Augen den Vorteil, dass ich sehr kleine Aliquote habe, die auch noch sehr lange haltbar sind. Zum Reaktivieren nehme ich dass ein Eppi aus dem Kühlschrank, gebe die Kügelchen auf Agar oder in Flüssigkultur und schon gehts mit dem Wachstum weiter.

Glycerin macht natürlich nur Sinn, wenn man das Ganze einfrieren will, da es cytotoxisch ist und nach dem Einfrieren relativ schnell wieder entfernt werden sollte. Allerdings finde ich die Idee mein "Verdünnungsmedium" mit 10% Glycerin zu Versehen und die Spritzen dann einzufrieren durchaus interessant.

Viele Grüße
Christoph
P.S. vielen Dank für die Paper, ich habe sie mal kurz überflogen, habe aber aktuell nicht die Zeit mich genauer damit auseinander zu setzen, was ich aber auf jeden Fall noch tun werde.


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