AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig :-(

Rezepte und Petrischalen gießen

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AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig :-(

Beitrag von GrafDracula » Montag, 22. April 2019 17:46

Hallo,

ich hab mir jetzt schon nen paar mal frische AGAR-Petrischalen gemacht. Wenn sie dann noch relativ frisch sind und ich innerhalb von ein paar Tagen Pilzsporen von nem Sporenabdruck drüberstreue (ohne auf dem AGAR rumzureiben), dann keimen die Sporen nach 1-2 Tagen. Hab ich die Petris allerdings schon ein paar Wochen gelagert, dann funzt das meistens nicht mehr.

Lagern tue ich meine Petris in einer Luftdichten Box, in die ich ein paar Sprüher 3%iges H2O2 reinsprühe vor'm Zumachen. Wenn ich nach ein paar Wochen die Petris raushole, ist noch H2O2 an den Wänden der Box (Fingerkuppen werden immer noch weiß, wenn mans berührt). In den Petris ist direkt nach dem Sterilisieren noch ein ganz klein wenig Kondenswasser, was nach ein paar Wochen aber wahrscheinlich vom AGAR aufgenommen wird.

Ich merke auch, dass wenn ich ne Petrischale öffne und gaaaaanz leicht mit der Fingerkuppe drauftippe, dass es mir so vorkommt, als wenn sich eine ganz leichte "Pelle" oben drauf gebildet hat. Meine Theorie ... wenn ich auf die Pelle Sporen draufstreue, dann liegen die quasi im Trocknen und keimen nicht mehr. Austrocknen tun die aber definitiv nicht in der Luftdichten Box, denn auch nach Monaten der Lagerung so, ändert sich der Zustand nicht mehr, aber diese "Pelle" ist immer noch da.

Wie lagert ihr, wie beimpft ihr, habt ihr auch so eine "Pelle" nach längerer Lagerung, oder was muss ich anders machen???
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von ABMkoch » Montag, 22. April 2019 19:23

Ich habe das Problem bei gelagerten Platten nicht. Allerdings benutze ich kein Wasserstoffperoxid. Ich nehmen an es liegt daran. Sporen sind besonders empfindlich gegen Wasserstoffperoxid. Myzel besitzt ein Enzym namens Katalase, welches das Wasserstoffperoxid zersetzt. Die Sporen nicht.
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von GrafDracula » Montag, 22. April 2019 19:40

Dann müsste aber das Wasserstoffperoxid bei der Lagerung quasi in die Petrischalen hineinkommen und sich dort "anreichern" ... und sobald ich dann die Sporen raufstreue, ist das AGAR durch das H2O2 dann schon nicht keine Lebensfreundliche Umgebung - oder wie?
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von GrafDracula » Mittwoch, 24. April 2019 06:52

So, hatte am Sonntag ehh noch neue Petris angesetzt ... aber irgendwas läuft grad bei mir falsch, oder sehr sehr komisch ... seit Wochen schon keimen bei mir keine Sporen mehr ... die frischen Petri's hab ich diesmal zwar wieder in der luftdichten Box, diesmal aber nur 2 Eßl. destilliertes Wasser unten rein gemacht, damit so minimal Umgebungsfeuchte herrscht.

Weil die eigentlich immer am besten gekeimt sind, hab ich versuchshalber mal getrocknete Morcheln über die frisch sterilisierten & ausgekühlten Petris (MEA) ausgeklopft. Zusätzlich hab ich einfach unsteril in Petris eine 5%ige Wasser/Malz-Lösung gekippt und darüber auch bestimmt von 10 verschiedenen getrockneten Morcheln was abgekratzt und dann nochmal was davon unters Mikroskop mit 10-Minütiger Serienbildaufnahme, weil ich mal sehen wollte, wie es keimt. Temperatur ist bei ~20-22°C.

Letztens ist bei einem Versuch mal schon nach 1 Tag Myzel gewachsen und jetzt nach 2 Tagen noch rein gar nichts zu sehen, weder Petris, noch Flüssig, noch unterm Mikroskop ... und unterm Mikroskop ist ein Bröckchen mit bestimmt ca. 50 Sporen im Fokus ... ich versteh's grad echt nicht, was schief läuft :(

Ich stell jetzt mal ne Petri 1h offen auf den Balkon und eine andere grapsch ich mit dreckigen Händen an ... mal sehen, ob da überhaupt IRGENDWAS drauf wächst ... oder in meiner Umgebung wird durch meine besondere Aura neuerdings einfach ALLES Steril ...
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von ohkw » Mittwoch, 24. April 2019 07:03

Was für ein Rezept hast du denn für die Nährböden verwendet?

Ich lasse die Petrischalen nach dem Gießen immer ein paar Tage stehen (gestapelt mit Abdeckung). Dann sieht man auch ob die sauber sind. Dann wickel ich sie in Frischhaltefolie und verpacke sie in Zip-Gefriersäcke. Auf die Art kann man sie sehr lange im Kühlschrank lagern.

Rezept:
Agar Agar 25g/L
Malzextrakt 20g/L
Bierhefe 2g/L
Pepton 2g/L
Schlämmkreide 0,5g /L
Magnesiumsulfat 0,5g/L


da wächst dann eigentlich alles wie verrückt ;)

Edit: Pepton vergessen...
Zuletzt geändert von ohkw am Mittwoch, 24. April 2019 16:50, insgesamt 1-mal geändert.
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von GrafDracula » Mittwoch, 24. April 2019 09:18

Ich nehm immer folgendes:
- Agar Agar ----> 17g/L (ist grad so noch fest, knapp über Gelartig, aber schön feucht dadurch)
- Malzextrakt --> 50g/L (viel hilft viel :) ... zu viel isses nicht, es wuchs ja bisher alles sehr gut da drauf)
- Hefeextrakt --> 20g/L (ist auch recht viel, aber wie oben, bisher ist alles sehr gut da drauf gewachsen)

PH-Wert ist so um die 6,5 +-0,5 ... kann nur grob messen mit den Teststreifen die ich hab.

Bisher ist da auch immer alles wie blöd drauf gewachsen, egal, ob ich Test der Umgebungsluft, Sporen, Klone, oder sonstwas versucht habe ...

Ich mach's aber aus Ermangelung eines HEPA ehh immer andersrum ... erst alles zusammenrühren, aufkochen, Petri's gießen, Agar abkühlen & fest werden lassen, 1/2 bis 3/4h bei 2-2,5bar sterilisieren, 12h abkühlen lassen und dann in die luftdichte Plastikbox rein. Kondenswasser ist zwar bisserl am Deckel, da ich aber weniger Fotos davon machen will, sondern das Zeugs da drin nur wachsen soll, hat mich das nie gestört, auch mit Kontis hatte ich bisher keine Probleme ...

PS: Hab grad nochmal geschaut ... auch wenn 5% Malz sich viel anhört, bin ich damit noch weit entfern von Konzentrationen, wo Pilz-Myzele nicht mehr wachsen können:
Quelle --> "Feste Marmelade mit einem Zuckergehalt über 60 Prozent. Zucker in diesen Konzentrationen wirkt konservierend"
Quelle --> "Für die Erzielung einer ausreichenden Haltbarkeit sind im Falle von Bakterien Zuckerkonzentrationen von 15 - 50 %, im Falle von Hefen sogar solche von 45 - 60 % erforderlich."
Bakterien kommen wohl generell wesentlich schwerer mit hohen Zuckerkonzentrationen zurecht, Pilze sind da scheinbar sehr tolerant.
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von ABMkoch » Mittwoch, 24. April 2019 12:09

Ihr nutzt aber "fette" Medien. Mein Standard:

12,5g Agar bakteriologisch
15g Malzextrakt
2g Hefeextrakt
1g Pepton
1g Kaliumdihydrogenphosphat
10mg Thiamin

pH eingestellt mit HCl auf 5,8 (vor dem autoklavieren).
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von GrafDracula » Mittwoch, 24. April 2019 12:17

Vielleicht ist meine Mischung wirklich etwas zu "fett" ??? ... vielleicht mögen die Sporen zur Keimung wirklich lieber ein bisserl weniger fette Konzentration. Ich rühr mal neue Petris an und versuch mal, ob's mit weniger besser funktioniert.

Oder sind meine Sporen inwzischen zu alt?
Oder sind die 22°C zum keimen zu kalt?
Oder, oder, oder ...

2 Fragen noch ABMkoch:
--> wozu soll das Kaliumdihydrogenphosphat gut sein?
--> wo beziehst du das Thiamin her?
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von ABMkoch » Donnerstag, 25. April 2019 18:48

GrafDracula hat geschrieben:Vielleicht ist meine Mischung wirklich etwas zu "fett" ??? ... vielleicht mögen die Sporen zur Keimung wirklich lieber ein bisserl weniger fette Konzentration. Ich rühr mal neue Petris an und versuch mal, ob's mit weniger besser funktioniert.

Oder sind meine Sporen inwzischen zu alt?
Oder sind die 22°C zum keimen zu kalt?
Oder, oder, oder ...

2 Fragen noch ABMkoch:
--> wozu soll das Kaliumdihydrogenphosphat gut sein?
--> wo beziehst du das Thiamin her?
Kaliumdihydrogenphosphat zusammen mit den Aminosäuren aus dem Pepton dienen als Puffer. Zudem ist Phosphat ein essentieller Nährstoff für die Pilze.

Das Thiamin beziehe ich von Carl Roth.
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von GrafDracula » Donnerstag, 25. April 2019 20:32

ABMkoch hat geschrieben:Das Thiamin beziehe ich von Carl Roth.
Oha ... da hab ich mal Pepton etc. bestellt ... da wird man arm, wenn man da bestellt :-)
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von ohkw » Donnerstag, 25. April 2019 20:44

Für das Thiamin kannst du auch Hefeextrakt bzw. besagte Bierhefe verwenden. https://de.wikipedia.org/wiki/Hefeextrakt
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von ABMkoch » Samstag, 27. April 2019 11:16

GrafDracula hat geschrieben:
ABMkoch hat geschrieben:Das Thiamin beziehe ich von Carl Roth.
Oha ... da hab ich mal Pepton etc. bestellt ... da wird man arm, wenn man da bestellt :-)
Für einen Laborhandel sind die vergleichweise günstig. Teilweise kann man über 1000 Euro für das Kilo Agar oder Pepton bei manchen Händlern bezahlen.

Und dafür, dass ich eine zuverlässige gleichbleibende Qualität bekomme zahle ich gerne etwas mehr. Schwankungen in der Qualität würden mich da unter Uständen viel mehr kosten...
ohkw hat geschrieben:Für das Thiamin kannst du auch Hefeextrakt bzw. besagte Bierhefe verwenden. https://de.wikipedia.org/wiki/Hefeextrakt
Hefeextrakt hat nur wenige mg Thiamin pro 100g. Manche Pilze profitieren aber von >10mg/L Nährboden. Daher supplementiere ich es separat.
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von GrafDracula » Sonntag, 28. April 2019 20:35

So, die Keimung klappt wieder ... lag wohl scheinbar wirklich am H2O2 ... toll, was man sich durch so' ne "doofe" Idee für Probleme an Land ziehen kann ...

Und als Dank gibts nen paar schöne Fotos von kleinen frisch gekeimten Morchel-Sporen, also quasi wenige Stunden alte Mini-Morchel-Babys :-)

Ist übrigens normales Malz-Agar mit 20g Malz/L und 25g AGAR/L ... aus getrockneten Morcheln, von denen ich seitlich was runtergekratz habe, die Klumpen in der Mitte der frischen Myzele sind also Stückchen mit mehreren Sporen. Wenn ich mir so ein einzelnen Stückchen unterm Mikroskop anschaue, sind da bestimmt 100 Sporen dran.
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Re: AGAR nach ein paar Wochen Lagerung nicht mehr keimfähig

Beitrag von ohkw » Montag, 29. April 2019 08:47

Sieht interessant aus.

@ABMkoch
Interessant, dass einige Pilze von so hohen Thiaminkonzentrationen profitieren. Bierhefe ist eigentlich das Thiamin-reichste mir bekannte Lebensmittel. Ist das rein in der Laborkultur so, oder verwendest du das auch in den Substratkulturen? Um welche Pilzarten handelt es sich dabei? Ich habe festgestellt dass Bierhefe ein billiger Wachstumsbeschleuniger in den Endsubstraten ist, allerdings auch für Kontaminationen. Setzt du Biotin auch zu?
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