Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

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Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Ständerpilz » Montag, 04. Juli 2016 20:32

Hallo,

ich möchte euch die Software "Picolay" nicht vorenthalten. Wenn man mikroskopiert, dann ist ja selten alles scharf. Man muss also durch das Objekt durch fokussieren, um einen Gesamteindruck zu bekommen. Wenn man nun von den verschiedenen Schärfeebenen jeweils Fotos macht (einen z-stack), dann kann man die einzelnen Bilder zu einem durchgehend scharfen Bild zusammen rechnen. Für dieses "Focus stacking" (auch "Extended depth of field" oder "Deep Focus Fusion") gibt es diverse Programme. Eins davon ist das kostenlose "Picolay".

http://www.picolay.de/

Hier gibt es einen Artikel über Picolay und was man damit alles machen kann: http://www.biospektrum.de/blatt/d_bs_pdf&_id=1404574

Interessant ist ja die Möglichkeit 3D-Bilder aus einem z-stack zu generieren. Im Idealfall sind die Abstände zwischen den z-Ebenen gleich und bekannt, aber man kann sich etwas behelfen, wenn das nicht möglich ist.

Ich persönlich bin sehr neugierig auf das "hologram stacking", welches verborgene Strukturen sichtbar machen soll. Ich habe nämlich mal einen Stack von Hibiscus-Pollen gemacht, wo ich das Problem hatte, dass die damals von mir verwendete Software Strukturen anhand des Kontrastes erkennt, aber leider den maximalen Kontrast heranzieht, so dass feine Strukturen verloren gingen. Ich hänge mal ein Beispielbild von Hibiscus rosa sinensis Pollen an, welches ich noch mit "Combine ZP" erstellt habe. Wie man sieht, sind die "Stachel" auf der Oberfläche nicht so gut zu erkennen. Ich hoffe, dass es mit "hologram stacking" bessere Ergebnisse bringt, insbesondere auch bei anderen Malvenarten.
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Hibiscus_pyramid_wa.jpg
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Re: Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Lauscher » Dienstag, 05. Juli 2016 08:02

Das sieht ja mal cool aus!
Ich werde beizeiten auch mal Stacking-Versuche machen.
Hast Du einen Trick, um möglichst gleiche Abstände in der z-Achse hinzubekommen? Oder einfach Feingefühl beim Drehen?
Ich habe picolay mal heruntergeladen, mit Hilfe von wine startet es auch in debian. :-)
Für Linux wird Macrofusion empfohlen; es will momentan nicht starten, ich muß mal gucken, woran es hakt.
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Re: Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Ständerpilz » Dienstag, 05. Juli 2016 09:25

Man kann die z-Achse motorisieren, dass ist aber entweder teuer oder kompliziert umzusetzen. Am einfachsten ginge es wohl, wenn man eine Skala am Feintrieb hat, so dass man immer x Striche weiter dreht. Aber nur für mehr Tiefenschärfe ist das nicht so furchtbar wichtig, dass die Abstände genau gleich sind.

Ich hab das gestern mal etwas ausprobiert und es funktioniert auch mit Picolay, der große Aha-Effekt blieb allerdings leider aus. Bei Gelegenheit schaue ich mir das aber noch mal genauer an.

Stacker gibt es viele. Für Linux weiß ich nicht, das nutze ich zwar auch, aber für andere Dinge.
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Re: Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Lauscher » Donnerstag, 14. Juli 2016 17:30

Ich habe erste Stackingversuche gemacht. Serienbilder sind mir noch nicht gut gelungen, aber ich konnte Videoaufnahmen von der Kameravorschau machen. Ich habe das Video in Einzelbilder zerlegt, und habe mit Picolay ein erstes vorzeigbares Stackingbild hinbekommen, Blütenpollen in Honig:
Pollen_in_Honig_stack.jpg
Macrofusion habe ich zum Laufen bekommen, es scheint aber nur wenige Bilder verarbeiten zu können, keine großen Serien. Ist eher für Makrofotografen gedacht, die 10-20 Bilder machen.
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Re: Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Ständerpilz » Donnerstag, 14. Juli 2016 18:25

Prima! :) Von welcher Pflanze ist der Pollen? Raps?
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Re: Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Lauscher » Donnerstag, 14. Juli 2016 18:28

Prima! :) Von welcher Pflanze ist der Pollen? Raps?
Da muß ich meine Bienchen fragen, wo sie denn gewesen sind ...
Aber Raps ist gut möglich bis wahrscheinlich! Die Probe ist aus einem Rapshonigglas. (Mit nicht 100% Raps)
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Re: Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Ständerpilz » Donnerstag, 14. Juli 2016 21:28

Du hast einfach Honig auf einen Objektträger gegeben?
Wenn du mal Pollen direkt von der Blüte mikroskopierst, kannst du ja mal Glycerin nehmen. Das hellt optisch sehr auf und wirkt einfach "klarer", als mit Wasser.

Hast du mal die 3D-Gif-Funktion ausprobiert? Nach dem Stack gehst du im Ergebnisfenster auf 3D-Ansicht und aktivierst dann "Rocking GIF". Das ist ganz witzig. :)

Im Honig kannst du nun ja die Anzahl der Pollenkörner bestimmen, indem du sie mit Fiji/ImageJ zählst und dann hochrechnest. Falls das irgendwie für dich interessant ist ^^
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Re: Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Ständerpilz » Donnerstag, 14. Juli 2016 21:33

Ich habe auf der Arbeit auch eins gemacht. Das würde ich zuhause nie so gut hinkriegen. Und der Hibiscus-Pollen ist einfach ideal, da die mit dem orangen Pollenkitt überzogen sind.
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Hibiscus_40x_DFF_01.jpg
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Re: Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Lauscher » Samstag, 16. Juli 2016 14:30

Du hast einfach Honig auf einen Objektträger gegeben?
Ja. :) Geht gut, ordentlich plattdrücken, und man kann viele Kristalle und einzelne Pollen erkennen.
Wenn du mal Pollen direkt von der Blüte mikroskopierst, kannst du ja mal Glycerin nehmen. Das hellt optisch sehr auf und wirkt einfach "klarer", als mit Wasser.
Das klingt interessant! Ich denke auch mal, Glyzerin ist zähflüssiger als Wasser, was auch ein Vorteil ist. Dann schwimmen mir die interessanten Objekte nicht so schnell weg, und Fotomotive wackeln weniger.
Hast du mal die 3D-Gif-Funktion ausprobiert? Nach dem Stack gehst du im Ergebnisfenster auf 3D-Ansicht und aktivierst dann "Rocking GIF". Das ist ganz witzig. :)
Mit "Rocking GIF" habe ich irgendwie keine richtigen Ergebnisse bekommen, vllt. habe ich irgendwas falsch ausgewählt. Ich bekam nur ein wackelndes Bild einer unscharfen Einzelaufnahme.
Die Relieffunktion hat mal interessante Ergebnisse hervorgebracht, die ich aber im Augenblick auch nicht wiederholen kann. Wahrscheinlich habe ich irgendetwas verkonfiguriert. Ich habe die Picolay.ini jetzt mal gelöscht, beim nächsten Versuch geht es vllt. wieder.
Im Honig kannst du nun ja die Anzahl der Pollenkörner bestimmen, indem du sie mit Fiji/ImageJ zählst und dann hochrechnest. Falls das irgendwie für dich interessant ist ^^
Prinzipiell gibt es interessante Anwendungsfälle. Im Falle des Blütenpollens aber schwierig, weil zum einen in einer Mikroskopprobe Honig nur 5-10 Pollen auf dem Objekträger zu finden sind (und die meisten davon dick in Kristalle gepackt, was imagej nicht mögen dürfte), und ich zum anderen nicht weiß, wie ich die Winzmenge auf einem Objektträger auf große Mengen hochrechne. Ich denke, ich bräuchte eine Waage, die mir 1000stel Gramm oder noch weniger anzeigt, die so eine Probe wiegt.
Interessant könnte so etwas z.B. sein, um eine Gelbrost-Sporenbelastung in einer Getreidestaubprobe hochzurechnen.
Ich habe auf der Arbeit auch eins gemacht. Das würde ich zuhause nie so gut hinkriegen. Und der Hibiscus-Pollen ist einfach ideal, da die mit dem orangen Pollenkitt überzogen sind.
Ein wunderschönes Bild! Ich bin beeindruckt!
Was hast Du zuhause für eine Kamera? Ich habe in den letzten Tagen mit Computerfernsteuerung meiner Canon experimentiert (mittels gphoto2), da geht eine Menge. Nikon soll in der Hinsicht auch viele Möglichkeiten bieten. Andere Hersteller bieten teils auch Möglichkeiten, aber meist mit weniger Optionen.

Du kennst Dich doch mit Mikrocontrollern und dergleichen aus. 8)
Ich überlege, ob es möglich ist, einen preisgünstigen Schrittmotor (gibt es ab 20,-) mittels Gummiband mit dem Feintrieb des Mikroskops zu verbinden und mit debian anzusteuern. Ist das mit vertretbarem Aufwand machbar, oder spinne ich nur?
Ich denke z.B. an eine Verkabelung mit einem RS232-Anschluß. Die Stromversorgung des Motors muß wahrscheinlich extra geregelt werden? Oder wäre das über USB denkbar? Du siehst, ich habe keine Ahnung. :D
Hier ein Forenthread mit interessanten Basteleien, Schrittmotor mit Kamera oder Mikroskop kombiniert

Ich würde das gern mit Kamerabefehlen kombinieren, so daß z.B. die Kamera ein Foto macht, der Schrittmotor anschließend den Feintrieb minimal weiterdreht, und nach 2-4 Sekunden Erschütterungsberuhigungszeit das nächste Foto gemacht wird.
Bei sehr gleichmäßigen Abständen der Schärfeebenen wird auch die Hologramm- oder Relieffunktion von Picolay interessant, weil sie dann eher reale Höhenunterschiede anzeigen kann.
Ich habe versucht, von kleinen Sporen Stackingaufnahmen zu machen, doch die Ergebnisse sind eher miserabel. Dafür braucht es doch etwas feineres als meine Finger am Feintrieb.
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Re: Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Ständerpilz » Samstag, 16. Juli 2016 17:22

Lauscher hat geschrieben:Prinzipiell gibt es interessante Anwendungsfälle. Im Falle des Blütenpollens aber schwierig, weil zum einen in einer Mikroskopprobe Honig nur 5-10 Pollen auf dem Objekträger zu finden sind (und die meisten davon dick in Kristalle gepackt, was imagej nicht mögen dürfte), und ich zum anderen nicht weiß, wie ich die Winzmenge auf einem Objektträger auf große Mengen hochrechne. Ich denke, ich bräuchte eine Waage, die mir 1000stel Gramm oder noch weniger anzeigt, die so eine Probe wiegt.
Interessant könnte so etwas z.B. sein, um eine Gelbrost-Sporenbelastung in einer Getreidestaubprobe hochzurechnen.
Och, das geht ganz einfach. Man könnte z. B. eine größere Menge Honig nehmen und den Wasser lösen. Der Pollen dürfte sich in dem Wasser dann nach einiger Zeit unten absetzen (ausgenommen vielleicht windbestäubter Pollen, wie Pinus). Wenn du dann den Überstand ganz vorsichtig abschüttest, hast du den Pollen nicht nur weitestgehend frei von Kristallen, sondern auch konzentrierter. Angenommen du beginnst mit 10 ml Honig und 90 ml Wasser (=100 ml, entsprechend eine 1:10-Verdünnung) und hast am Ende 1 ml Wasser mit Pollen, dann dürftest du etwa 10x so viele Sporen auf dem Objektträger haben. Vorausgesetzt du hast nicht versehentlich die Hälfte des Pollens weggekippt ;)
Ein wunderschönes Bild! Ich bin beeindruckt!
Was hast Du zuhause für eine Kamera? Ich habe in den letzten Tagen mit Computerfernsteuerung meiner Canon experimentiert (mittels gphoto2), da geht eine Menge. Nikon soll in der Hinsicht auch viele Möglichkeiten bieten. Andere Hersteller bieten teils auch Möglichkeiten, aber meist mit weniger Optionen.
Das habe ich nicht mit meiner privaten Kamera aufgenommen, sondern mit einer Axiocam Mrc fürs Mikroskop.
Du kennst Dich doch mit Mikrocontrollern und dergleichen aus. 8)
Ich überlege, ob es möglich ist, einen preisgünstigen Schrittmotor (gibt es ab 20,-) mittels Gummiband mit dem Feintrieb des Mikroskops zu verbinden und mit debian anzusteuern. Ist das mit vertretbarem Aufwand machbar, oder spinne ich nur?
Ich denke z.B. an eine Verkabelung mit einem RS232-Anschluß. Die Stromversorgung des Motors muß wahrscheinlich extra geregelt werden? Oder wäre das über USB denkbar? Du siehst, ich habe keine Ahnung. :D
Hier ein Forenthread mit interessanten Basteleien, Schrittmotor mit Kamera oder Mikroskop kombiniert
Möglich ist grundsätzlich alles. So eine z-stack-Motorisierung würde ich von jemanden übernehmen, der schon eine gebaut hat. Da gibt es einige in Mikroskopierforen. Wozu das Rad neu erfinden? Den Thread muss ich mir gleich mal genauer angucken.
Ich würde das gern mit Kamerabefehlen kombinieren, so daß z.B. die Kamera ein Foto macht, der Schrittmotor anschließend den Feintrieb minimal weiterdreht, und nach 2-4 Sekunden Erschütterungsberuhigungszeit das nächste Foto gemacht wird.
Das dürfte die Hauptanwendung sein ;)

Denkbar wäre zusätzlich auch noch eine x,y-Motorisierung. Dann könntest du auch Bilder vom ganzen Objektträger machen und die dann zusammensetzen. Geht zum Beispiel auch mit ImageJ, aber auch mit Photoshop etc.
Bei sehr gleichmäßigen Abständen der Schärfeebenen wird auch die Hologramm- oder Relieffunktion von Picolay interessant, weil sie dann eher reale Höhenunterschiede anzeigen kann.
Ich habe versucht, von kleinen Sporen Stackingaufnahmen zu machen, doch die Ergebnisse sind eher miserabel. Dafür braucht es doch etwas feineres als meine Finger am Feintrieb.
Ja, das ist nicht einfach. Wenn du eine Skalierung hast, dann kannst du ja immer einen Strich weiter drehen, dann sind die Abstände zumindest gleichmäßig.

Zur Präparation von Pollen und die mikroskopische Beurteilung kann ich dir nur wärmstens den Henkel empfehlen: http://www.klaus-henkel.de/pollen.pdf
Da dürften für dich viele interessante Dinge drin stehen.
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Re: Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Lauscher » Sonntag, 17. Juli 2016 15:16

Das habe ich nicht mit meiner privaten Kamera aufgenommen, sondern mit einer Axiocam Mrc fürs Mikroskop.
Ok, ich hatte schon verstanden, daß dieses Bild an Deiner Arbeit entstand und nicht mit Deiner privaten Kamera. ;-) Ich dachte nur, es wäre interessant zu sehen/zu wissen, was mit Deiner privaten Kamera per Computersteuerung/gphoto2 möglich ist.
Denkbar wäre zusätzlich auch noch eine x,y-Motorisierung. Dann könntest du auch Bilder vom ganzen Objektträger machen und die dann zusammensetzen
Interessanter Gedanke - das noch mit z-Stacking kombiniert, und die CPU fängt an zu rauchen. :-D
Ja, das ist nicht einfach. Wenn du eine Skalierung hast, dann kannst du ja immer einen Strich weiter drehen, dann sind die Abstände zumindest gleichmäßig.
Für ganz feine Stackingbewegung wäre mir eine Skala noch zu grob - ich möchte den Feintrieb noch feiner drehen, also winzigste Schritte machen.
Zur Präparation von Pollen und die mikroskopische Beurteilung kann ich dir nur wärmstens den Henkel empfehlen: http://www.klaus-henkel.de/pollen.pdf
Da dürften für dich viele interessante Dinge drin stehen.
Interessanter Link, danke!

Ich habe von meinem Bruder soeben einen ausgedienten Fischertechnik-Plotter geschenkt bekommen, an dem 2 Schrittmotoren mit loser Kabelage dran sind, gerettet aus einem Uni-Physik-Abfalleimer:
IMG_7428.JPG
IMG_7429.JPG
Der Motor hat keinen Aufdruck, aber optisch verglichen dürfte es das Modell 32311 sein.
Ein Prospekt zum Plotter.

Ich schaue gerade, ob es sinnvoll sein könnte, diese Motoren zu verwenden. Die Gretchenfrage ist hier, wie ich die Motoren ansteuern kann. Es gibt/gab wohl fischertechnik-Interfaces für C64, Amiga, Atari usw., programmierbar mit Zeilennummer-BASIC. :mrgreen:
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Re: Mikroskopie: Focus stacking und 3D-Bilder mit Picolay

Beitrag von Ständerpilz » Sonntag, 17. Juli 2016 18:52

Da musst du mal gucken, wie andere das machen. Ich habe hier privat nur ein ganz einfaches Mikroskop, keine Steuerung. Auf der Arbeit habe ich aber auch keine motorisierten Achsen, sondern muss von Hand drehen. Für mich privat lohnt sich das nicht. Ansteuern könnte man Motoren auch mit Arduino und den wiederum an den PC anschließen.
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