geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkieseln

Schrägagar, Trocknen, steriles Wasser

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Christoph1988
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geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkieseln

Beitrag von Christoph1988 » Freitag, 29. August 2014 22:07

Hallo zusammen,
beim Stöbern in einem alten Mikrobiologiebuch bin ich gerade auf eine in meinen Augen geniale, aber trotzdem einfache Methode zur Einlagerung von Mikroorganismen (im speziellen Bakterien und Pilze) gestoßen, die ich euch nicht vorenthalten will. Die Lagerung erfolgt im Kühlschrank für 7-10 Jahre.

Die Methode nennt sich wie schon erwähnt Einkieseln, wobei es zwei Möglichkeiten mit Silicagel sowie mit unglasierten Porzellankügelchen gibt, wobei ich mich der Einfachheit halber auf die letztere Beschränke. Ihr braucht für eine Kultur ein verschraubbares Reagenzglas aus Glas (1,5 bzw 2ml Eppi müsste auch gehen), welches ihr im unteren Drittel mit je einer Schicht Silicagel, Glasfasern und unglasierten Porzellankügelchen (meiner Meinung nach müsste auch Seramis etc funktionieren) füllt. Das Ganze wird oben mit einem Wattebausch verschlossen, autoklaviert und anschließend bei 100°C getrocknet.
Nun gebt ihr eine Impföse eures Pilzes von einer Petrischale oder Schrägagarkultur auf 1ml 10-20%ige Magermilchlösung (steril) und homogenisiert das Ganze.
Nun entfernt ihr den Wattebausch von dem vorbereiteten Reagenzglas, gebt einige Tropfen der beimpften Magermilchlösung auf die Porzellankügelchen (nicht zu viel) und verschließt das Ganze mit einem sterilen Schraubdeckel. Zu letzt erfolgt die Lagerung eine Woche bei Raumtemperatur, wobei das Silicagel den Kügelchen langsam aber sicher die Feuchtigkeit entzieht (vgl. Exsicator) und anschließend im Kühlschrank.
Zum Wiederbeleben der Kultur gebt ihr einfach einige Kügelchen auf eine sterile Petrischale mit Nähragar und fertig.

Als Nachteilig sei noch die geringere genetische Stabilität gegenüber Tiefkühllagerungen zu nenne, die in unserem Fall aber nebensächlich sein dürfte. Besonders genial neben der Einfachheit finde ich die Tatsache, dass man einfach unter sterilen Bedingungen einige Kügelchen aus einem Ansatz entnehmen kann, diese auf eine Petrischale oder in eine Flüssigkultur wirft und somit wieder eine vitale Kultur hat.

Zu guter Letzt würde mich eure Meinung zu der Methode interessieren und hoffe, dass es neben mir einige leute gibt, die das ganze ausprobieren und uns ihrer Erfahrungen dazu mitteilen.

Viele Grüße
Christoph
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von Christoph1988 » Freitag, 19. September 2014 18:43

Nach einiger Wartezeit, werde ich das Ganze nun mal ausprobieren.

Wie bereits angekündigt, werde ich versuchen, das Ganze etwas "down zu scalen" und 2ml-Eppis für jedes Aliquot zu benutzen. Dazu habe ich die Eppis bis etwa 0,8ml mit Silicagel-Kugeln gefüllt und diese mit etwas Glaswolle (Watte geht auch) verdämmt. Darauf kamen dann einige Krümel Seramis.
19092014230.jpg
Anschließend wurden die Eppis mit etwas Watte verschlossen und im 10er Pack in Autoklavierbeutel verpackt.
19092014236.jpg
In dieser Form werden die kleinen jetzt autoklaviert und ein paar h bei 100-120°C im Trockenschrank getrocknet, wobei das Silicagel die beim autoklavieren aufgenommene Feuchtigkeit verliert. Auf die Seramiskügelchen wird dann unter der Cleanbench 10µl einer 10%igen Magermilchlösung (Schutzmedium) mit angeimpftem Pilz pipettiert und das ganze verschlossen. Anschließend erfolgt die Lagerung eine Woche bei Raumtemperatur, wobei das Silicagel dem Seramis langsam die Feuchtigkeit entzieht und anschließend im Kühlschrank (Einfrieren müsste auch möglich sein).

Ich bin gespannt, wie das Ganze ausgeht und würde mich über anregende Kommentare freuen.

Viele Grüße
Christoph
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von geriull » Mittwoch, 24. September 2014 20:09

Servus Christoph,

Klingt und sieht wirklich spannend aus was du hier machst!
Ich (als Chemiker) finde diese Methode hoch interessant und denke, dass sie funktionieren wird.
Bitte jedenfalls weiter berichten, wenns gelingt, bin ich der erste, der sich Silikagel und Eppis zulegt!

Liebe Grüße!

Geri
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von Christoph1988 » Sonntag, 28. September 2014 07:25

Hallo Geri,
vielen Dank für dein Interesse. Leider ist das Ganze kurz ins Stocken geraten, da sich Magermilchlösung schlecht autoklavieren lässt und sterilfiltriert werden muss. Ich hatte schon alles vorbereitet und steril unter der Cleanbench liegen, als ich festgestellt habe, dass die Filter, die ich mir sterilisiert hatte eine PTFE-Membran hatten, die ja hydrophob ist. Daher heißt es jetzt erstmal hydrophile Spritzenfilter besorgen, alles wieder autoklavieren und dann einen neuen Versuch starten.

Nebenbei habe ich die Idee schon etwas weiter getrieben. Meine Idee ist es mit möglichst wenig Aufwand eine Stammkultur mit möglichst vielen kleinen Aliquots anzulegen, auf die ich dann bei jeder neuen Kultur zurückgreifen kann. Das hat den charmanten Vorteil, dass ich den Rest meiner Kultur keiner Konterminationsgefahr aussetze und trotzdem immer eine frische Starterkultur habe.
Die Idee geht daher etwas in Richtung Microtiterplatte. In jedem der 96 Wells liegt dann eine Kultur einzeln steril verpackt. Ober drüber wird einfach eine Folie draufgeschweißt, die zur Entnahme kurz mit Ethanol abgewischt und dann durchstochen wird.
Sollte ich dabei wieder mit Seramis arbeiten, müsste es so fein gemahlen sein, dass es zum Aufziehen (Entnahme) durch eine Spritzenkanüle oder Pipettenspitze passt. Die Alternative wäre vielleicht Flüssigmedium mit Parafinöl überschichtet. Die Kapazität eines Wells liegt bei etwas mehr als 100µl, also nicht gerade viel.

Was hälst du von der Idee?
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von geriull » Montag, 29. September 2014 19:32

Hallo Cristoph!
Ja, der Griff zum richtigen Spritzenfilter ist wichtig!
Ich verwende für wässrige Lösungen gerne NylonFilter.
Die halten dafür aber keine Lösungsmittel aus.
Deine Idee mit den Mikroportionen finde ich fabelhaft.
Als Polymerchemiker kenn ich leider diese Platten nicht so gut, aber wenn das gemeinsame (aufeinmal) Verschweißen der gesamten Öffnungen geht, dann halte ich die Methode mit dem Durchstechen der Folie am Besten! Auf diese Weise hast du unzählige Lagerfläche Urstarterkulturen auf einmal. Und wenn du einmal unsteril übermittelt haben solltest, hast du noch immer viele gleichwertige Urkulturen übrig....
Aber was nimmst du als Ur-und Lagergebäude? Die Kügelchenidee hat was!
Vielleicht geht Silicagel so wie es zu Trocken- Zwecken verwendet wird. (Ohne Kobaltchlorid versteht sich;-) )
Man könnte die Kügelchen mit feuchter Mycelsuspension alle gemeinsam beimpfen und anschließend einzeln verschweißen....

Bin gespannt wie du es nun anstellst. ..

Geri

bist du auch ein Chemiker?
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von Christoph1988 » Mittwoch, 08. Oktober 2014 21:42

Hi Geri,
der zweite Versuch hat auch nichtgeklappt, da das Albumin warscheinlich den 0,2µm Spritzenfilter (Medizinbedarf Braun, keine Ahnung, was für ein Material) zugesetzt hat. Eventuell hat das Filtermaterial auch das Formaldehyd bei der Sterilisation nicht vertragen. Beim nächsten Mal autoklviere ich das Zeug einfach und gut.

Die Sache mit den Mikrotiterplatten teste ich, wenn es in den Eppis geklappt hat. Die Vorteile der Urstarterkulturen hatte ich auch bei der Idee. darum finde ich sie auch so charmant. Die Platten selbst haben eine glatte Oberseite und um jedes Well ist nochmal einen etwa 2mm breiten Kunststoffring (die ganze Platte ist vermutlich PC). Von daher ist das Verschweißen problemlos möglich. Wenn man das Ganze noch trockenen möchte, könnte man erst eine Lage Autoklavierpapier aufschweißen, was Wasserdurchlässig ist. Das Ganze trocknet man unter der Bench und dann wird nochmal eine luftdichte Kunststofffolie drüber geschweißt.

Das Probleme sehe ich momentan eher in der Entnahme. Die muss relativ schnell gehen um Kontis zu vermeiden. Da ist es unzweckmäßig erst Medium reinzupipettieren, das inkubieren zu lassen und es dann wieder raus zu pipettieren. Daher denke ich, dass das Granulat (Seramis oder Silicagel (natürlich ohne CoCl2) so fein und hyrophil sein muss, dass man kurz Medium draufpipettiert und dann die komplette Suspension wieder aufzieht und überführt.

Silicagel aht allerdings den nachteil, dass es sich bei der Wasseraufnahme erwärmt. Man müsste das Ganze also vor dem Inkubieren auf etwa 0°C abkühlen und auch die Mycelsuspension mit 3-4°C draufgeben. Von daher ist es warscheinlich Zielführender Seramis oder Keramikpulver zu benutzen und das Silicagel nach dem verschweißen nur für die Tropcknungsphase draufzugeben. Oder wie gesagt Flüssigkultur und mit Parafinöl überschichten.

Ich studiere übrigens momentan Biosystemtechnik im dritten Mastersemester. Damit bin ich kein reiner Chemiker, bin aber auch nicht ganz unbedarft in der Richtung.

Viele Grüße
Christoph
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von Reblaus » Mittwoch, 28. Januar 2015 00:02

Hallo Christoph,

wie sieht's bei dir aus? Hast du Erfolge mit der Methodik?

Bin am überlegen mit Paraffinöl herumzuexperimentieren. Kultur in kleinem Einweckglas ansetzen und dann mit Öl überschichten. Analog zu der Geschichte Schrägagar + Öl.

Bild

"Methoden des mykologischen Laboratoriums" Von Hanns Kreisel und Frieder Schauer


VG
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von kornpilz » Samstag, 31. Januar 2015 15:41

Hört sich sehr intressant an!


Ich habe glaube mal bei einem video über champion zucht gesehen. das die Mycel kügelchen ins subtrat werfen.
Habe mich schon die ganze zeit gefragt wie die hergestellt sind oder aus was.
Könnte ja auf deiner technik aufbauen.
Wisst ihr was ich mein mit Mycelkügelchen.
Alle Pilze sind essbar , manche nur einmal ;-)
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von Christoph1988 » Sonntag, 01. Februar 2015 03:57

Hi reblaus,
momentan liegt das Projekt ein bisschen auf Eis, da meine Sprizenfilter um die Magermilchlösung steril zu filtrieren zu fein waren und verstopft sind. Autoklavieren ging auch nicht gut, da kam eine Art Pudding raus.
Daher bin ich momentan auf der Suche nach einem autoklavierbaren Schutzmedium, habe aber auf Grund meines Studiums nicht sonderlich viel zeit für das Projekt.

Die Sache mit dem Parafinöl ist ne gute Sache. Davon habe ich auch schon öfter gehört. Es soll eine einfache, zuverlässige Methode sein. Wichtig ist dabei nur das Parafinöl richtig zu sterilisieren. Autoklavieren reicht da nicht aus, sondern wie in deiner Anleitung beschrieben min 4h bei 180°C.

@kornpilz
bei der champizucht wird es sich vermutlich um einfache Körnerbrut oder ähnliches handeln, was für größere Substratmengen und kontinuierliche Produktion sicherlich einfacher und billiger ist als die hier disskutierte Methode
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von Reblaus » Dienstag, 03. Februar 2015 20:14

Hallo,

einfach und zuverlässig hat mich auch überzeugt.

Zum Sterilisieren: 4 h bei 180 °C finde ich ganz schön extrem. Andererseits muss man nicht bei Überdruck arbeiten und kann ein Ölbad oder die Backröhre verwenden.

Ich wollte mir Öl in Arzneibuchqualität holen. Das sollte weitgehend sauber sein. Mal sehen ... . Prof. Schauer hat das Büchlein zu DDR Zeiten geschrieben. Vielleicht war es schwieriger an hochwertiges Paraffinöl zu kommen als heute.

VG
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von Christoph1988 » Donnerstag, 05. Februar 2015 07:24

Ich habe in mehreren Quellen von der Methode gelesen und in allen steht, dass das Sterilisieren des Parafinöls der kritischste Part ist. Wie Schauer schreibt reicht es auch nicht einmal eine große Flasche zu sterilisieren und diese dann wieder und wieder zu benutzen, sondern er empfielt eindeutig kleine Aliquots um die Konterminationsgefahr zu minimieren.
Du solltest das sterilisierte Parafinöl also ähnlich sorgsam wie steriles Nährmedium behandeln. Dann solltest du keine Probleme haben.
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von Ständerpilz » Samstag, 12. November 2016 13:52

Hallo,

mich interessiert dieses Thema sehr! Kann irgendjemand über Versuche und möglicherweise auch Erfolge bezüglich Langzeitkonservierung berichten?

Sonst hätte ich vielleicht noch ein paar andere Ideen, die möglicherweise funktionieren könnten, wie z. B. Einkapselung in Alginat.

Grüße

Oliver
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von Mykoma » Sonntag, 11. März 2018 17:47

Ich bin zwar erst am Anfang der Pilzzucht, mache mir aber auch schon gedanken, wie ich meine späteren Kultutren konservieren kann und bin auf dieses Paper gestoßen:
Conservation in sterile distilled water (OpenSource)
DOI: 10.1016/j.mex.2014.04.002

Hier wird die Lagerung von mit Mycel besiedeltem Papier unter sterilem Wasser bei 4 °C untersucht und das Mycel ist nach 1.5 Jahren immer noch vital. An anderen Stellen habe ich auch schon von der Unterwasser-Methode gelesen und es wird berichtet, dass das Mycel auch bei Raumtemperatur gelagert werden könne - auch über 1.5 Jahre hinaus... der Platzbedarf ist nach dem Paper natürlich nicht so optimal, allerdings sollten sich auch hier z.B. Eppis eignen oder man legt eben ein etwas größeres Stück Papier ein, von welchem man dann nach Bedarf kleine Fetzen abtrennen könnte.
Interessant finde ich die Vorgehensweise, die Papierstückchen auf das Agar zu legen und dann das Mycel darüber hinwegwachsen zu lassen, um es dann leicht zu übertragen.
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von Ushiab » Mittwoch, 14. März 2018 09:05

Sehr interessant!
Ich hätte vermutet, dass das Mycel nach einiger Zeit an Sauerstoffmangel stirbt, aber scheinbar klappt's.
Was mich noch wundert ist, dass das Wasser destilliert ist. Schadet dass nicht den Zellen?

LG
Mykoma
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Re: geniale, einfache Methode zur Langzeitlagerung - Einkies

Beitrag von Mykoma » Freitag, 16. März 2018 06:40

Da käme es wohl auf einen Versuch an - ich habe die Tage mal etwas Mycel vom Judasohr wie auch vom rauchblättrigen Schwefelkopf zur Reinigung auf Agar aufgebracht. Werde es mit beiden dann mal in Microcaps testen (einige bei RT und ein paar im Kühlschrank).
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